作物真菌或細(xì)菌病害是導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低的重要因素。殺菌劑被用來防治這些病害,保持作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品的品質(zhì)。水稻是亞洲各國(guó)種植的***重要作物之一。水稻的生產(chǎn)仍然受到許多病原微生物的威脅,需要新穎的殺菌劑來穩(wěn)定地防治這些病害。
Tolprocarb是日本三井化學(xué)農(nóng)業(yè)公司開發(fā)的防治水稻稻瘟。∕agnaporthe grisea)的殺菌劑。稻瘟病對(duì)水稻生產(chǎn)有極大危害,此病害的病原菌已產(chǎn)生抗性,故對(duì)其防治是一大挑戰(zhàn)。
雖然有許多作用機(jī)制的殺菌劑能用于防治此病害,但一些殺菌劑防效已不佳。稻瘟病抗性菌株,例如抗呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ——醌外位點(diǎn)細(xì)胞色素bc1(醌外部抑制劑:Qol)抑制劑或黑色素生物合成中脫水酶抑制劑(黑色素生物合成抑制劑——脫水酶抑制劑;MBI-Ds)菌株產(chǎn)生。對(duì)tolprocarb的2種作用機(jī)制進(jìn)行了研究:抑制黑色素生物合成途徑中聚酮合酶(MBI-P)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性。由于tolprocarb具有獨(dú)特的作用機(jī)制,推測(cè)靶標(biāo)真菌發(fā)展抗性的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)低。Tolprocarb不僅對(duì)稻瘟病,而且對(duì)細(xì)菌病害有強(qiáng)的生物活性,對(duì)哺乳動(dòng)物或環(huán)境的影響小。本文介紹了tolprocarb的合成、生物活性和作用機(jī)制。
1 合成
1.1 先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)
在對(duì)卵菌綱病害殺菌劑開發(fā)的過程中,發(fā)現(xiàn)化合物1對(duì)水稻稻瘟病有防治作用;衔1和纈霉威(iprovalicarb)僅在甲基的有無和羰基的位置不同。卵菌綱病原菌殺菌劑纈霉威對(duì)稻瘟病沒有活性。有趣的是化合物1對(duì)卵菌綱植物病原菌如使馬鈴薯和番茄發(fā)生枯萎病的晚疫病菌(Phytophthora infestans)沒有活性。纈霉威結(jié)構(gòu)的小小改變,其殺菌活性譜發(fā)生很大變化,化合物1的作用機(jī)制不同于纈霉威。
在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,稻瘟病菌菌絲由于形成黑色素而變黑,而用化合物1處理后,菌絲的延長(zhǎng)沒有被抑制,而顏色變白;衔1處理的菌絲的顏色不同于用傳統(tǒng)MBI處理的,這表明用化合物1和MBI處理后,積累的中間物不同。此外,研究表明化合物1和MBI-D沒有交互抗性。這些結(jié)果表明化合物1作用于黑色素生物合成途徑中新的靶標(biāo)位點(diǎn)。因此以化合物1為先導(dǎo)物,對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。
1.2 先導(dǎo)化合物的優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系
先導(dǎo)化合物1的結(jié)構(gòu)被分成3個(gè)部分:A-C,對(duì)每部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了總結(jié)。
基團(tuán)A中的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯鍵比酰胺或脲鍵有更高的活性。在A基團(tuán)端的異丙基被2,2,2-三氟乙基取代后化合物活性增加。甲基氨基甲酸酯衍生物比異丙基氨基甲酸酯衍生物的活性低;鶊F(tuán)B中的S-對(duì)映異構(gòu)體比R-對(duì)映異構(gòu)體的活性高。三氟甲基衍生物和異丙基衍生物的活性水平相同。正丙基衍生物的活性低于異丙基衍生物。疏水異丁基和親水的甲基磺酰甲基(methylsulfanyl methyl group)的引入會(huì)降低化合物的活性。
基團(tuán)C中,引入對(duì)甲基比引入鄰甲基或間甲基活性高。在對(duì)位引入氯原子比引入甲基的活性低。未取代化合物比2-和3-甲基類似物活性高,但比4-甲基和4-氯類似物的活性低。C環(huán)4-位的取代好像能提高活性。
***后,在考慮各種因素后,例如在田間試驗(yàn)的長(zhǎng)殘留活性,選擇tolprocar來開發(fā)。
2 合成
以N-叔丁氧基羰基-(N-Boc-)保護(hù)的L-纈氨酸甲酯(a)合成tolprocarb。首先與硼氫化鈉發(fā)生還原反應(yīng),之后發(fā)生Mitsunobu偶聯(lián)反應(yīng),再肼解生成胺衍生物(d)。之后形成酰胺鍵,再去N-Boc保護(hù)后得到胺衍生物(f)。***后胺衍生物(f)和氯甲酸酯(g)發(fā)生反應(yīng)生成tolprocarb。
3 抑制菌絲的生物合成
3.1 作用機(jī)制
在1965年,三共株式會(huì)社(現(xiàn)在稱為三井化學(xué)農(nóng)業(yè)公司)開發(fā)了MBI和2,3,4,5,6-五氯苯甲醇。在20世紀(jì)70年代研究了黑色素生物合成的還原酶抑制劑(黑色素生物合成還原酶抑制劑;MBI-Rs),在20世紀(jì)90年代研究了MBI-Ds。已知淺藍(lán)菌素為黑色素生物合成過程中的聚酮合酶(PKS)抑制劑,但在tolprocarb進(jìn)入市場(chǎng)、實(shí)際應(yīng)用之前,沒有能抑制PKS的其他化合物,tolprocarb是一款實(shí)踐意義上抑制PKS的殺菌劑。
在tolprocarb開發(fā)的早期,就發(fā)現(xiàn)在含有tolprocarb的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)稻瘟病菌菌落時(shí),稻瘟病菌的著色受到了抑制。與用含有傳統(tǒng)的MBI,例如MBI-R或MBI-D的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落相比,含有tolprocarb的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落著色少。進(jìn)行了恢復(fù)試驗(yàn)來評(píng)估了tolprocarb的作用機(jī)制。用含有黑色素中間體和tolprocarb的瓊脂培養(yǎng)稻瘟病菌來測(cè)定絲狀菌落的顏色。在含有tolprocarb瓊脂培養(yǎng)基上的顏色淺的菌落再在含有1,3,6,8-四羥基萘(1,3,6,8-THN)的培養(yǎng)上培養(yǎng),菌落的顏色恢復(fù)正常。因此,推測(cè)tolprocarb通過抑制調(diào)節(jié)聚酮合酶和酮內(nèi)酯(pentaketide)環(huán)化的1,3,6,8-THN上游的聚酮合酶活性而抑制菌落的著色。這通過測(cè)定含有稻瘟病菌的PKS基因的轉(zhuǎn)基因米曲霉(Aspergillus oryzae)中1,3,6,8-THN積累的量來測(cè)定。與一些傳統(tǒng)的MBI相比,只有tolprocarb抑制離體PKS的活性。這些結(jié)果表明tolprocarb作用于稻瘟病菌PKS,這不同于其他傳統(tǒng)的MBI。由于此作用機(jī)制,殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)(FRAC)把tolprocarb分為MBI-PKS(MBI-P)類別。
3.2 對(duì)稻瘟病菌生命周期的影響
MBI-D和MBI-R等傳統(tǒng)MBI對(duì)稻瘟病菌生命周期的影響已被確定。這些殺菌劑抑制稻瘟病菌附著胞的黑化作用,阻礙分生孢子從分生孢子梗分散。也發(fā)現(xiàn)了tolprocar對(duì)這些細(xì)胞和孢子的作用。***可能的是,MBI-D/MBI-R和tolprocarb抑制稻瘟病菌附著胞的黑化,阻礙分生孢子的分散。暴露于tolprocarb的脫色分生孢子比有色分生孢子對(duì)陽光(紫外線光)更敏感。用tolprocar處理后的脫色分生孢子的發(fā)芽率要低于用MBI-D或MBI-R殺菌劑處理的,甚至在多云或雨天(紫外線強(qiáng)度:500~2 000 μW/cm2)。用投射電子顯微鏡法(TEM)發(fā)現(xiàn)附著胞或分生孢子的黑化作用被抑制。稻瘟病菌附著胞的黑化對(duì)侵染釘產(chǎn)生膨壓,滲透進(jìn)入寄主細(xì)胞重要。相比之下,對(duì)分生孢子中黑色素功能研究不多。如前所述,MBI抑制分生孢子從分生孢子梗分散,但具體機(jī)制未知。然而,黑化作用與分生孢子從分生孢子梗分散的能力有關(guān)。
4 系統(tǒng)性獲得抗性(SAR)
4.1 擬南芥系統(tǒng)性獲得抗性
SAR是植物體的非特異性系統(tǒng)性免疫響應(yīng),由信號(hào)化合物水楊酸(SA)誘導(dǎo)產(chǎn)生。NPR1和WRKY45調(diào)節(jié)SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的不同病程相關(guān)基因,例如PR-1、PR-2、PR-5和PBZ1,這些基因編碼葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等PR蛋白,還調(diào)節(jié)植物抗毒素合成途徑。
測(cè)定含有煙草PR-1a啟動(dòng)子-Fluc(熒光素酶)報(bào)告基因框架(PR-1a:Fluc)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究表明tloprocarb能誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。在擬南芥的2個(gè)生長(zhǎng)階段:剛發(fā)芽和3周齡大的植株中發(fā)現(xiàn)了PR-1a啟動(dòng)子的活性。在處理擬南芥苗后96 h,檢測(cè)到擬南芥苗中PR-1a啟動(dòng)子活性;灌溉處理成熟植株后96、120 h檢測(cè)到植物體內(nèi)PR-1a啟動(dòng)子的活性。用tolprocarb處理成熟擬南芥葉片,10 d后接種十字花科黑斑病菌(Pseudomonas syringae pv. maculicola,Psm),評(píng)估tolprocarb對(duì)此病菌的防治潛力。接種3 d后,Psm侵染量降低。結(jié)果表明tolprocarb處理能誘導(dǎo)SAR活性。
4.2 水稻SAR活性
已確定tolprocarb是擬南芥SAR活性的強(qiáng)誘導(dǎo)劑,因此評(píng)估了tolprocarb是否能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生SAR活性。用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)用tolprocarb處理后水稻中PR基因的活性。在處理后24 h或72 h,tolprocarb促進(jìn)SA-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá),例如PBZ、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶1。相反,其不促進(jìn)茉莉酮酸-(JA-)-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)的基因表達(dá)。這些表明tolprocarb通過加速SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)SAR活性。
已知SA和JA為誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫力的信號(hào)傳導(dǎo)化合物。特別是,SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑與保護(hù)植物免受病原真菌或細(xì)菌危害的功能有關(guān)。因此,預(yù)期tolprocarb具有防治水稻細(xì)菌病害的潛力,發(fā)現(xiàn)具有防治水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)的活性。
Tolprocarb能阻止水稻葉上病害癥狀的擴(kuò)展。tolprocarb主要通過MBI-P活性而對(duì)稻瘟病有效,但不清楚是否第2種作用機(jī)制——SAR活性也在其中起作用,且一直難以發(fā)現(xiàn)是MBI-P還是SAR所致活性。Hiroyuki Hagiwara等人應(yīng)用黑色素中間體的2個(gè)恢復(fù)試驗(yàn)來區(qū)分它們。首先,在用黑色素中間體1,8-二羥基萘處理的水稻葉上接種稻瘟病菌,培養(yǎng)。再在表面交聯(lián)(SCL)的瓊脂培養(yǎng)基上接種稻瘟病菌,培養(yǎng),通過人工培養(yǎng)基上的附著胞來觀察稻瘟病菌的侵染。在第1個(gè)試驗(yàn)中,tolprocarb處理阻止了水稻細(xì)胞上的黑色素恢復(fù)的稻瘟病菌的附著胞滲透入水稻。而后tolprocarb處理后沒有抑制SCL培養(yǎng)基上的病原菌的滲透。這兩個(gè)結(jié)果表明活體植物細(xì)胞對(duì)tolprocarb處理后阻止黑色素恢復(fù)的稻瘟病菌侵染必要。因此,這表明tolprocarb通過2種作用機(jī)制抑制稻瘟病菌的侵染:MBI活性和誘導(dǎo)寄主的防御響應(yīng)。
5 對(duì)稻瘟病的活性
5.1 在田間對(duì)稻穗頸瘟的活性
含有9%或4% tolprocarb的顆粒劑是內(nèi)吸性殺菌劑,用于育苗箱中植物的根部,含有3% tolprocarb的顆粒劑施于水稻田水中。Tolprocarb對(duì)葉瘟和穗頸瘟有強(qiáng)的防治活性,尤其對(duì)穗頸瘟的防效特別高。用約束極大似然法進(jìn)行的meta分析和2007-2015年用9%或4% tolprocarb顆粒劑處理的育苗箱的田間試驗(yàn)防效數(shù)據(jù)證實(shí)了此特性。3%顆粒劑用于水稻田水處理的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明在水稻抽穗前5~29 d處理對(duì)穗頸瘟有優(yōu)異的防效。
Tolprocarb在各種類型土壤中都穩(wěn)定;在36種類型土壤中吸附較小,包括日本的25種火山土,土中的有機(jī)碳含量、陽離子的交換能力、磷酸的吸收能力和pH等這些因素都對(duì)吸附?jīng)]有影響。試驗(yàn)土壤的吸附率為7%~42%,而20%~100%吸附的tolprocarb能被水解吸。
5.2 對(duì)抗性菌株的活性
水稻病害抗性菌株的出現(xiàn)影響了水稻的生產(chǎn),是水稻種植中一大問題。在日本,抗MBI-D或QOl菌株的出現(xiàn)成為水稻生產(chǎn)中的難題。tolprocarb對(duì)抗MBI-D或Qol菌株有穩(wěn)定的防治作用,將會(huì)是實(shí)際應(yīng)用中防治水稻真菌病原菌很好的選擇。
6 總結(jié)
Tolprocarb是從iprovalicarb類似物的衍現(xiàn)的,但其作用機(jī)制完全不同于MBI-P。Tolprocarb也能誘導(dǎo)擬南芥和水稻產(chǎn)生SAR,通過誘導(dǎo)SAR活性而對(duì)細(xì)菌病害和稻瘟病有很強(qiáng)的活性。由于這兩個(gè)作用機(jī)制和防效高,抗性不易產(chǎn)生。在水稻田,tolprocarb顆粒劑對(duì)稻瘟病有高的防效,對(duì)穗頸瘟有的防效,包括對(duì)MBI-D或Qol殺菌劑有抗性的菌株。根據(jù)這些特點(diǎn),tolprocarb對(duì)不僅稻瘟病而且細(xì)菌病害的水稻病害有穩(wěn)定的強(qiáng)的防效。tolprocarb用于作物生產(chǎn)將會(huì)有很好的前景。
來源: 世界農(nóng)藥